Fluorescentna mikroskopija: načela metode

Apsorpcija i ponovnog emitiranja svijetla daljnjih anorganskih i organskih tekućina je rezultat fosforescencija fluorescencije. Razlika između pojava je trajanje intervala između apsorpciju i emisiju svjetlosti toka. Kada fluorescencija tih procesa se događa gotovo istovremeno, dok fosforesciranje - s malim zakašnjenjem.

povijesni podaci

U 1852, britanski znanstvenik Stokes, prvi opisao fluorescencije. On je uveo novi pojam kao rezultat pokusa s fluorit, koje emitiraju crveno svjetlo pod ultraljubičastim svjetlom. Stokes je istaknuo zanimljiv fenomen. Utvrđeno je da je valna duljina fluorescentnog zračenja je uvijek veći od protoka svjetlosti uzbude.

Za potvrdu hipoteze u 19. stoljeću bilo je mnogo eksperimenata. Oni su pokazali da različite uzorke fluoresciraju pod utjecajem UV zraka. Među materijalima, između ostalog, bio kristala, smole, minerala, klorofila, sirove droge, anorganski spojevi, vitamine, ulja. Izravna uporaba bojila za biološka ispitivanja započela tek 1930. godine

Fluorescentne mikroskopije: Opis

Neki od materijala koji se koriste u prvoj polovici studija 20. stoljeća pokazao je visoku specifičnost. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Zahvaljujući izvedbi, koja se ne može postići uz pomoć kontrastnih metoda, metoda fluorescentne mikroskopije je postao bitan alat u biomedicinskim i bioloških istraživanja. Jednako važni rezultati dobiveni su i za materijale.

? Koje prednosti radi metodom fluorescentne mikroskopije? Korištenje novih materijala postalo je moguće i izbor vrlo specifičan stanica submicroscopic komponenti. Fluorescentna mikroskopija može otkriti pojedinačne molekule. Razne boje omogućuju identifikaciju više stavki odjednom. Unatoč ograničenim prostornim rješavanja granice difrakcije opreme, koji se, pak, ovisi o specifičnim svojstvima uzorka, identifikacijski molekula ispod ove razine je sasvim moguće. Razni uzorci nakon zračenja izložbeni autoflorescencijom. Ovaj fenomen je naširoko koristi u petrologija, botanike, industriji poluvodiča.

Značajke

Studija životinjskih tkiva ili patogene često komplicirane ili preslab ili vrlo jake nespecifični autofluorescencija. Međutim, vrijednost u studiju stječe uvod u materijal komponente uzbuđeni pri određenoj valnoj duljini i emitira potreban intenzitet svjetlosti toka. Fluorokromi djeluju kao boje koji mogu neovisno spojene na strukture (vidljivih ili nevidljivih). Tako oni imaju visoku selektivnost do cilja, a kvantni prinos.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescentna mikroskopija je naširoko koristi od pojave prirodnih i sintetičkih bojila. Oni posjeduju određene profile intenzitet emisije i uzbude i ciljano na određene biološke mete.

Identificiranje pojedinačnih molekula

Često, u idealnim uvjetima, možete se registrirati zasebni element sjaj. Za to je, između ostalog, potrebno je osigurati dovoljno nizak šum detektora i optički pozadini. Fluoresceinje molekula na neuspjeh zbog photobleaching može se smjestiti do 300 tisuća. Fotona. U 20% prikupljanja efikasnosti postupka, a može ih se prijaviti u iznosu od oko 60 tisuća kuna.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescentne mikroskopije na temelju lavina fotodiodama ili elektroničkom množenja, omogućilo istraživačima da promatraju ponašanje pojedinih molekula kroz drugog, a u nekim slučajevima čak minuta.

složenost

Ključno pitanje u korist suzbijanju optičkog pozadinske buke. S obzirom na činjenicu da su mnogi od materijala koji se koriste u izradi filtera i objektiva pokazuju neke autoflorescencijom, napori znanstvenika u ranim fazama su orijentirane na proizvodnju komponenata koje imaju nisku fluorescenciju. Međutim, kasniji eksperimenti doveli su do novih zaključaka. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Konkretno, utvrđeno je da je fluorescentna mikroskopija, na temelju ukupne unutarnje refleksije, to omogućuje postizanje niske pozadinu i visok intenzitet uzbude svjetlo.

mehanizam

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Načela fluorescentnim mikroskopom, na temelju potpuno unutarnje odbijanje je korištenje nes- talnih val ili kratkotrajan. To se događa na granici između medija s različitim indeksa refrakcije. U tom slučaju, svjetlosni snop prolazi kroz prizmu. Ona ima visok loma parametar indeksa.

Prizma uz vodenu otopinu ili staklo s niskim parametra. Ako zraka svjetlosti usmjerene na to pod kutom koji je kritičniji, snop potpuno ogleda iz sučelja. Ovaj fenomen je, pak, uzrokuje nonpropagating valove. Drugim riječima, stvara elektromagnetsko polje koje prodire u mediju s nižim indeksa loma parametar udaljenosti manjoj od 200 nanometara.

Razmagljivanje val intenzitet svjetlosti bi bila dovoljna da uzbudi fluorofore. Međutim, zbog svoje iznimno male dubine, njegov volumen će biti vrlo mali. Rezultat je pozadina na niskoj razini.

modifikacija

Fluorescentne mikroskopije se temelji na potpuno unutarnje odbijanje, može se provoditi s epi-osvjetljenje. To zahtijeva leće s visokim numerička apertura (najmanje 1,4, ali je poželjno da je postignut 1,45-1,6), a djelomično osvjetljena aparat polja. To se postiže s malom veličinom točke. Veću ujednačenost tankom prsten, koji blokira dio struje. Za kritične kut, nakon čega je totalna refleksija, trebamo visoku razinu loma uranjanja medija u objektivu i pokrovne čašu mikroskopom.