Molekularna metoda genetska istraživanja

Za istraživanje i prepoznati varijante struktura DNA upotrebljava molekularno genetičke metode. Za svaku DNA regije koja istražuje ovu regiju kromosoma, ili alela gena, postupci razlikuju. Svaki osnovni molekularni genetički postupak obuhvaća neke druge manipulacije ili RNA i DNA. Sve ove metode karakterizira ogroman složenosti, bez laboratorijskim uvjetima se ne može provesti, a osoblje mora biti visoko kvalificirani. Ovaj rad se odvija u nekoliko faza.

faze

Prvo, RNA ili DNA uzorci će se proizvoditi. Ovdje, molekularni genetički postupak može se primijeniti u bilo koji materijal: kap krvi leukocita, fibroblasta kulturu, sluznica (struganje), pa folikula, - DNK se može dobiti iz bilo kojeg uzorka. To je pogodan za korištenje bilo molekularne genetičke metode i njihove različite opcije i već dugo izolirane DNA smrznuti. Druga faza je posvećen akumulacije željenim fragmenata (pojačanje) DNA, jer pomaže osigurati lančane reakcije polimeraze (in vitro u in vitro bez uključivanja živi organizam). Kao rezultat toga, odabrani fragment DNA umnožava ovim lančanoj reakciji, a količina DNA se povećava doslovno milijuna puta.

Treći korak u metodama molekularne genetski istraživanja pretpostavlja umnoženu ograničenje DNA fragmentacije (to, kidanje ili rezanje). Ograničenje izvodi pomoću elektroforeze na poliakrilamid ili u agaroznom gelu. Ovaj molekularne genetička metoda proučavanja DNA fragment omogućuje da se svi određeni položaj u gelu. Nakon toga, gel je obrađen s etidij bromidom, sposobni za vezanje na DNA, ozračivanje s ultraljubičastim svjetlom, tada je moguće promatrati luminescencije dijelove. Molekularno genetičke dijagnostičke metode su različiti i brojni, ali prva dva koraka su zajednički za sve. No, kako bi se identificirali DNK fragmenata, gel može biti u boji, i mnoge druge postojeće metode.

vrsta

Najizravniji i rasprostranjene metode za detekciju mikobakterija može uključivati gore navedeni postupak učenja molekulska genetska DNA. Njezina bit je da, kako bi se utvrdila lanca materijala specifičnih fragmenata DNA patogena skeniranja. Molekularno genetičke dijagnostičke tehnike još nemaju učinkovitiji način za prepoznavanje takvih bolesti kao tuberkuloze. Korištenje lančane reakcije polimeraze (PCR), možete biti sigurni da je originalna DNA će se povećati broj kopija u milijun puta, to jest, bit će pojačanje, a to će prikazati rezultate. Razina osjetljivosti je vrlo visoka - više od devedeset i pet posto, što je glavna prednost ove metode.

Ostatak molekularno-genetičkih metoda istraživanja o učinkovitosti daju više primjeraka doslovno udvostručila, jer u tom slučaju uzorak izrada pokazuje određeni oligonukleotid slijeda povećana na sto i šest puta. Čak je i kultura dijagnoze tuberkuloze dišnog sustava značajno smanjiti njegovu osjetljivost. To je razlog zašto je moderna medicina se temelji na molekularno genetičke metode dijagnosticiranja tuberkuloze. A, opisanim metoda je učinkovita pogotovo kada se radi o patogenima visoke antigenske varijabilnosti, odrediti da se na drugi način mnogo je teže - zahtijeva posebne hranjivih medija i kultiviranje dugo vremena. Biokemijskim i molekularno genetičke metode daju vrlo različite učinke na rezultate.

Dijagnoza tuberkuloze

Marshall PCR dijagnoza tuberkuloze najčešće pomoću tih sljedova DNA koji su specifični za sve četiri vrste bolesti. Da bi se postigao ovaj cilj često koriste početnika koji otkrivaju slijed je elemenata (IS-986, IS-6110), kao što su ovi elementi karakteriziraju vrlo migratornih vrsta Mycobacterium tuberculosis i uvijek prisutan više kopija u genomu. Također ekstrakcija DNA može se izvesti iz čistih kultura i kliničku (ispljuvku bolesnika) po bilo kojem drugom prikladnom metodom. Na primjer, tamo gdje se postupak Boom pufera koristi se na osnovi gvanidin tiocijanata i silicij, kao DNA nosač. Broj pacijenata koji se razlikuju slab bakteriološki povećava svake godine, pa je u kliničkoj praksi je uspostavio potpuno različite razine organizacije: molekularno-genetička metoda proučavanja DNA je igrao važnu ulogu u dijagnozi.

Ipak, moramo priznati da to nije bez nedostataka. PCR metoda je upotreba često donosi ogroman broj lažnih pozitivnih rezultata, a razlog je ne samo tehničke pogreške, ali i obilježja same metode. Osim toga, pomoću ove metode dijagnoze odrediti održivost mikobakterija, koje su identificirane, to je jednostavno nemoguće. No, taj nedostatak nije najvažnije. Molekularno genetičke metode PCR dijagnostika podrazumijeva rizik od kontaminacije mikobakterijske DNK. Zahtjevi za certifikaciju za tog razloga za PCR laboratoriju namijenjen isključivo teško, oni zahtijevaju tri odvojene prostorije. PCR tehnologija je moderan i vrlo složen, zahtijeva upotrebu odgovarajuće opreme i visoko osposobljeno osoblje.

bacterioscopy

Kada su rezultati dijagnoze analize treba usporediti s drugim podacima: klinički pregled, radiografiju, premazati mikroskopije, obrezivanje, pa čak i odgovor na specifične liječenja su vrlo važni. U ovoj seriji, PCR studije je samo jedna od komponenti. Otkrivanje patogen u ranoj dijagnostici može biti najjednostavniji i najbrži način - bakteriološki.

Tu se koristi svjetlosnog mikroskopa (bojanje Ziehl-Neelsen) i fluorescentne (bojanje fluorokrome). Prednost je brzina premazati rezultatima. No, njegova mana s pravom smatra ograničen kapacitet zbog niske osjetljivosti. Međutim, ova metoda daje preporuku koji je kao najekonomičniji i zemlju da otkrije bolesnika tuberkuloze. Otkrivanje mikobakterija bakteriološkog metode ima predviđenu vrijednost i procijenjena kvantitativno bakterija izlučivanje. Mnogo više samopouzdanja da se s njom molekularno genetičke metode istraživanja tuberkuloze.

kulture

Bolje otkrivanje mikobakterija prepoznati kulturalne studije. Sjetva patološki materijal je napravljen u medij jaja: Mordovsky, Finn II, LJ, i slično. Mjerila otpora mikobakterija na lijekove i neizravne dokaze o učinkovitosti brojnih mikobakterija i njihovih kolonija in vitro, ako primijenjene metode istraživanja kulture. Povećati postotak izolacije mikobakterija inokulacije patološke materijala se održava u različitim uvjetima.

Zadovoljavanje potreba brojna kulturna, patogena, uključujući potpore i tekućine. Koristi se u tom sustavu i automatizirano vrsta mjerenja VANTES rast. Usjevi se mora održati u inkubacije u trajanju do sedam do osam tjedana. Do tog vremena usjev s nedostatkom rasta može se smatrati negativnim. Najučinkovitiji način da se otkriju Mycobacterium tuberculosis u obzir biološke uzorke: dijagnostički materijal zaraziti zamorce, koji su izuzetno osjetljivi na TB.

Neke brojke

Zanimljivo područje istraživanja, koje je otvorio PCR dijagnostika bio je proučiti M. tuberculosis - latentnu infekciju. Suvremeni koncept TB infekciju upućuje na to da od stotinu ljudi koji su bili u kontaktu s M. tuberculosis, devedeset i može biti zaraženo, ali samo deset od njih su aktivna bolest se razvija. Drugi su imunitet TB, a zbog devedeset posto slučajeva infekcija ostaje latentna. Otkriti uzorak je pomogao molekularno genetsku metodu.

Genetičari kažu da pedeset i pet posto onih čiji usjevi patološki materijal bili negativni, a osamdeset posto ljudi zaraženih s M. tuberculosis, ali teče bez radioloških manifestacijama bolesti, PCR pozitivan odgovor dobili. To je genetski dijagnostička metoda pomoglo identifikaciji pacijenata ugrožena PCR istraživanjima s rezultatima njihovih analiza (mikroskopije i kultura) su negativne i subkliničkog infekcije M. tuberculosis bio prisutan.

moderna istraživanja

Ruske federacije i bakteriološke laboratoriji koristiti ubrzani postupak apsolutne koncentracije nitrata: aktivnost reduktaze mikobakterija testiranih Griess reagensom. Anti-TB centri koristiti metodu koja omogućava da se odredi otpornost na lijek. To sijanje u tekućim medijima, gdje automatizirani radiometrijsku i fluorescentna računovodstveni sustav rasta mikobakterija. Takva analiza je učinjeno brzo - do dva tjedna.

Trenutno se razvijaju nove metode: otpornost na lijek mikobakterija mjeri se na razini genotip. Proučavanje molekulskih mehanizama otpornosti gena i pokazuje prisutnost u mikobakterija. Ovi geni povezani sa otpornošću na određene lijekove. Na primjer, Kasa gena, inhA, katG otporan na izonijazidom, rpoB gena - rifampicinomje 16Sp RNA gena i rpsL - streptomicina, emb1 - na etambutol gyrA - što je fluorokinolona i tako dalje.

mutacije

Moderna dijagnostika znatno povećao metode molekularne-genetskoj razini za proučavanje DNK i smije obavljati velikih studije mutacija u svoj svojoj spektra. Sada znamo da je najčešći mutacije na 516, 526 i 531 kodona rpoB gena i identificirati otpornost na različite lijekove. Postoji čitav niz metoda za tipizaciju mikobakterija koriste ne samo tradicionalne metode - biokemijskih, bioloških i kulturnih, ali i široko koristi moderne genske tehnike molekularne. Već postoje odgovarajuća i pružaju ispravan način za dijagnozu detekciju monogenskih bolesti. Oni se temelje na DNK studijama u točnom području određenog gena. To je obično složen proces, dugotrajan i skup, ali podaci koje pružaju molekularno-genetičke analize, mnogo je točniji i informativan od podataka svih drugih analiza.

Odavno je poznato da je DNK ne mijenja tijekom cijelog života organizma da je u svakom stanica s jezgrom odnakova, a to omogućava da se analiza apsolutno sve stanice u tijelu, u bilo kojoj fazi posebnom pažnjom. Oštećena gena mogu se otkriti prije pojave prvih simptoma do full-scale klinička slika bolesti, kao i kod zdravih heterozigotnih ljudi, ali imaju mutacije u genu. Molekularni genetički nasljedna bolest dijagnostičke metode omogućuju da se otkrije na (izravni pristup, DNA-dijagnostiku), kao i za analizu segregacije bolesti u obitelji s marker lokusa DNK (genetski polimorfizam), koji su usko povezani s oštećenjem gena (tj, indirektno pristup DNA-dijagnostike). Direktno ili indirektno - bilo DNA dijagnostika temelji se na metode identificiranja strogo definiran dio ljudske DNA.

izravne metode

Izravne metode dijagnostike DNA su kad se zna krivac gen nasljedna bolest, kao što je dobro poznato, i vrste njegovih mutacija. Na primjer, pogodan izravne metode u brojnim bolestima. To Huntingtonove koreje (produžni CTG-ponavlja), fenilketonuriju (R408W), cističnu fibrozu (delF508, glavne mutacije) i slično. Glavna prednost izravnom metodom je dijagnostička točnost stopostotnom vlasništvu, i nema potrebe za napraviti DNK analizu ostatka obitelji. Ako se utvrdi da je mutacija u odgovarajućim genom, što omogućuje točno odobriti dijagnozu nasljedstvo, određivanje genotipa za ostatak opterećenom obitelji.

Još jedna prednost izravnog dijagnoze smatra identificirati heterozigot nosilac loših mutacija od rodbine i roditelja koji su umrli od bolesti. To posebno vrijedi za bolesti autosomno recesivno. Nedostaci izravnih metoda također su dostupni. Primijeniti ih, morate znati točno lokalizirati nenormalan gena, eksona-Intron strukturu svog spektra i njegove mutacije. Nisu svi monogenskih bolesti danas su dobili takve informacije. Informativnosti izravne metode ne može se smatrati potpuni, jer jedan te isti gen može imati veliki broj patoloških mutacija koja uzrokuje razvoj nasljednih bolesti.

indirektne metode

Neizravne metode u DNK dijagnostici se koriste na sve, u drugim slučajevima, ako je oštećen gen nije identificiran, ali samo kromosomski, ili ako je dijagnoza linija nije dao rezultat (to se događa, ako je gen kompleks molekularna organizacija ili u velikoj mjeri, ako postoji puno patološka mutacije). Indirektne metode provedena segregacija analizu polimorfnih biljega u alelima obitelji. Markeri se nalaze u istom ili lokus kromosomske regije usko povezan s bolesti i predstavljaju delecije ili insercije, točka zamjene, ponavljanja, a njihova je polimorfizam zbog različite količine stanica u bloku.

Najpogodniji za neizravne dijagnoza smatra mikrosatelitni i minisatellite polimorfizama koji su široko rasprostranjeni u ljudskom genomu. njihova vrijednost izražena u visokom informacijskog sadržaja, ako je oštećenje genetskog udaljenosti između marker i gena nije prevelika. U potonjem slučaju, točnost procjene određuje se u velikoj mjeri učestalost rekombinacije između polimorfnih biljega i oštećenja. Indirektne dijagnostičke metode pružaju obvezno preliminarni korak frekvencije alela za analizirane studije kod pacijenata populacije i nosača mutacija, plus nužnost određivanje vjerojatnosti rekombinacijom neravnoteže i adhezijske markera i mutanata alela.

druge metode

Kratki dijelovi RNA ili DNA, kao i jedan gen vizualizirati mikroskopskim istraživanja ne može se, dakle, da se identificiraju mutacije koje su potrebne molekularne genetske dijagnostike. Tu je „Genome Project Human”, kao i druge Napredak u molekularnoj genetici uvelike proširio mogućnost dijagnostici nasljednih bolesti - i pre i postnatalni. Te metode mogu pružiti rano otkrivanje i napraviti predviđanja poli- i monogenskih bolesti, čiji je debi odvija u odrasloj dobi. Nažalost, zbog tehničkih mogućnosti molekularne genetičke studije su ponekad izvan etičkih granica koje su postavljene u odnosu na nasljedstvo, posebno kada je dijagnoza u adolescenciji i djetinjstva.

Strukturna i numeričke kromosomske abnormalnosti su najčešći uzroci bolesti i raka, i mnogih malformacija. Kromosomske aberacije treba identificirati, što je važno za obiteljsko savjetovanje - za procjenu prognoze, zajedno s reproduktivnog rizika u budućim trudnoćama. Kromosom analiza je „zlatni standard” genetske dijagnoze, ali je ograničen. Samo su metode molekularne genetičke analize može učiniti više, jer ima koristi kloniranja tehnologija temelji fluorescentne oznake sposobne za svoje visoke osjetljivosti za prepoznavanje suptilnih kromosomske promjene koje su nemoguće otkriti klasične citogenetski. Ove tehnike su sve više širi naše dijagnostičke mogućnosti, kada se ispituje, djeca s teškoćama u razvoju, mentalnom retardacijom, s mnogim drugim nasljednim bolestima.

nalazi

To je vrlo važno za čovječanstvo su struktura gena i funkcije znanja, vrste varijabilnosti, sposobnost za otkrivanje nasljedne bolesti koje su se dogodile u vezi s razvojem molekularne genetike. njegovi postupci su usmjereni na proučavanje molekulu DNA - i kada je normalno, a kada je oštećen. Dobivanje sekvence deoksiribonukleinske kiseline (DNA iz nukleotida) i proteže se u fazama primanje uzoraka za identificiranje pojedinačnih fragmenata. Izolacija genomske DNA iz stanica, ograničenje (trganja), pojačanje (kloniranje), elektroforeza fragmenata (odvajanje njihove električni naboj i molekulsku masu na agaroznom gelu). Identifikacija specifičnih fragmenata koji se nalaze na površini diskretne pruge.

Zatim uzimajući u act posebne filtera, kroz koje prolazi svaki fragment hibridizacija klonirane DNA fragmenata ili sintetičke radioaktivnih sondi je kontrola, koji će biti jednak svakom ispitnom uzorku. Ako promijenite položaj ili dužinu usporedbi sa sondom, ako je novi ulomak ili nestalo - sve to ukazuje da analiziraju gen je kroz restrukturiranje u sekvenci nukleotida. Ima osam osnovne tehnike molekularno genetičke studije: sekvenciranja (Određivanje DNA sekvence), lančane reakcije polimeraze (povećanje broja sekvenci), priprema početnice poznatih gena, DNK kloniranje, proizvodnja rekombinantnih molekula izvedena proteina zbog rekombinantne molekule, stvarajući komplet (zbirka knjižnica) kloniran fragmenti koji su dobiveni pomoću ograničenje.